Pont annyi, amennyit beleteszel.



Loading


Mitokondriális légzés P/O hányadosának meghatározása

Respirációs kontroll és P/O hányados

  • Ép mitokondrium esetében megfelelő körülmények között a légzési szubsztrátok egyidejű ATP-szintézis mellett oxidálódnak, és az O2-fogyasztás oxigráffal mérhető.
  • Az oxidáció sebessége telítési-[S], -[Pi] és -[O2] jelenlétében csak a mitokondrium koncentrációjától és az ADP jelenlététől függ.
  • Az ADP → ATP átalakulás a [H+]-grádiens megszűntetése révén stimulálja az O2-fogyasztást. Ezt nevezzük az O2-fogyasztás akceptor-kontrolljának.
  • ADP hiányában a légzés lassú (nyugalmi), de ADP hozzáadásakor többszörösére nő (aktív).
  • Az ADP jelenlétében és elfogyása után mért sebességének aránya az oxidaáció és foszforiláció kapcsoltságára jellemző, és respirációs kontroll-hányadosnak nevezzük.
  • ADP-hozzáadás mellett az O2-felvétellel sztöchiometrikus arányban képződik ATP; a sztöchiometriai együttható az ún. P/O-hányados. Intakt mitokondriumban értéke attól függ, hogy a légzési láncba az oxidálódó szubsztrát melyik ponton lép be.
  • Szétkapcsoló szerek jelenlétében a P/O-hányados értéke csökken, mivel foszforiláció nem történik, ugyanakkor az O2-fogyasztás (légzés) nem változik, mert a szétkapcsoló szer csökkentve a [H+]-grádienst a légzést stimulálja.
  • Vannak olyan szerek, amelyek az egész mitokondriális légzést gátolják, így az oxidatív foszforilációt is.
  • Oligomicin: az ATP-szintézisét gátolja közvetlenül, de mivel a [H+]-grádiens nem használódik fel, a légzés is gátlódik.
  • Atraktilozid, karboxiatraktilozid: az FoF1 csatornát gátolja. Mivel a légzési lánc elektrontranszportja érintetlen, a protongrádiens kiépül, csak nem használódik fel, hasonlóan az oligomicin esetéhez. Ilyenkor szétkapcsolószerekkel a lassú légzést meg lehet gyorsítani.
  • N-, CO: a citokróm a3-at gátolják, így az utolsó lépés nem valósul meg, a légzés leáll, ATP-szintézis nincsen.
  • Antimycin-A: a III-komplexben a cit. b és c1 közötti elektronátmenetet gátolja.
  • Rotenon: NADH-dehidrogenázt gátolja, ami az I. komplex.
  • Malonát: a szukcinát-dehidrogenázt kompetitív módon gátolja, ami a II. komplex.
  • A protongrádiens terhére nem csak ATP-szintézis, hanem különböző kationok transzportja is megvalósulhat. azokat az anyagokat, amelyek kationokat juttatnak be a mátrixba, ionoforoknak nevezzük. Így ha a 2,3-DNP-lal szétkapcsoltuk a légzést és a foszforilációt, ionoforokkal a légzés stimulálható, mivel a protongrádiens terhére kationtranszport valósul meg.

Műszaki háttér

  • Az oldott oxigén mennyiségét polarográfiás oxigénelektróddal mérjük. Az elektródra a polarizátor 0.6 V feszültséget ad, ami mellett az oldott O2 elektrolítikusan redukálódik.
  • Ezen a feszültségen az elektródon átfolyó áram erőssége megfelelő, egyenletes keverés mellett, arányos az oldott oxigén pillanatnyi koncentrációjával, mely érték megfelelő átalakító segítségével egy rekorderen megjeleníthető.
  • A fentiek miatt a reakció ideje alatt a mérőedényt el kell zárni a levegőtől, hogy a keveredés közben a légkörből ne tudjon O2 beleelegyedni.
  • Az adott hőmérsékleten mérhető oldott oxigén koncentrációját 100%-ra kalibráljuk a műszeren. 0%-nak a Na-ditionit hozzáadása mellett mért értéket kalibráljuk.

Kivitelezés

A műszert az előzőek szerint kalibráljuk:

  • inkubáló oldatba helyezzük az elektródot és a rekorderen ekkor megjelenő adatot 100%-nak jelöljük
  • Na-ditionit hozzáadása mellett mért értéket 0%-nak jelöljük

P/O-hányadost határozunk meg:

  • inkubáló oldat
  • mitokondrium szuszpenzió
  • szubsztrát (pl. glutamát, malát, szukcinát)
  • nyugalmi légzést veszünk fel
  • ADP-hozzáadás (20μl)
  • aktivált légzés felvétele, majd a lecsengés után a nyugalmi
  • a P/O-hányados a hozzáadott ADP mennyiség és az O2-fogyás alapján határozható meg.

ADP, oligomicin, 2,3-DNP és KCN hatása az oxigénfogyasztásra

  • inkubáló oldat
  • mitokondrium szuszpenzió
  • légzési szubsztrát
  • ADP
  • felvesszük az oxigénfogyást
  • nagyobb adag ADP
  • oligomicin → csaknem leáll az oxigénfogyasztás (telítődik a protongrádiens)
  • 2,3-DNP-vel újraindítható (szétkapcsol)
  • KCN-nel ismét leáll (citokróm méreg)

Szukcinát oxidáció gátlása malonáttal

  • minden ugyanaz, mint a fentiekben
  • a légzési szubsztrát szukcinát, ami a II. komplexen lép be (szukcinát-DH)
  • ezt kompetitív módón gátolja a hozzáadott malonát
  • az oxigénfogyasztás csökken, nagyobb adag malonát mellett leáll

Karboxiatraktilozid hatása

  • légzési szubsztrát a glutamát-malát
  • ADP
  • majd gátlószer (karboxiatrktilozid)
  • szétkapcsolószerrel (2,3-DNP) újraindítható

QR Code
QR Code Mitokondriális légzés P/O hányadosának meghatározása (generated for current page)