Tartalomjegyzék
ADP, ATP, fruktóz-1,6-biszfoszfát és alanin hatása L és M típusú piruvát-kináz izoenzimekre. A mérés módszere.
Piruvát-kináz
- A glikolízis és a glukoneogenezis reakciói között a részfolyamatok többsége reverzibilis, irányuk és sebességük a mindenkori szubsztrátok és termékek koncentrációjától függ.
- A glikolízisben és a glukoneogenezisben három olyan irreverzibilis reakció van, ami meghatározza az átalakulás irányát, s ezen reakciók enzimei különböznek a glikolízis és glukoneogenezis között.
- Az egyik ilyen irreverzibilis reakció a glikolízisben a PEP → piruvát átalakulás, ami egyben szubsztrátszintű foszforiláció is, ADP foszforilálódik ATP-vé. Ezt a reakciót a piruvát-kináz katalizálja.
- A reakcióhoz Mg2+ szükséges:
PEP + Mg2+ + ADP → piruvát + Mg2+ + ATP
- A piruvát-kináz L, M és R típusú izoenzimeit ismerjük. Az L- a májban, az M- az izomban, az R-izoforma pedig a vörösvértestben található meg.
- A piruvát-kináz működése allosztérikus szabályozás alatt áll:
- az ATP, az L-alanin gátolja
- a fruktóz-1,6-biszfoszfát pedig serkenti. (feed forward)
- kovalens szabályozás:
- glukagon → foszforilál (aktiválja a cAMP függő protein-kinázt) → gátol
- inzulin → foszfoprotein-foszfatázt aktivál = defoszforilál → aktivál
Mérés
- Az enzim által katalizált reakcióban keletkezett piruvát a LDH által tovább alakítható laktáttá. Eközben NADH oxidálódik NAD-dá.
- A NADH 340 nm-en abszorpciós maximumot ad, így ezen a hullámhosszon fotometrálva az extinkció csökkenése a NADH csökkenését mutatja, ami közvetett módon a piruvát keletkezését jelzi.
- A megfelelő módon csatlakoztatott rekorder az extinkció változását grafikusan megjeleníti.
Kivitelezés
Az ATP és a FDP szabályozó hatásának vizsgálata
- vakminta: médium + PEP + NADH
- behelyezzük a fotométerbe, és beindítjuk a rekordert
- LDH
- PK-L
- 2 perc felvétellel felvesszük az alapvonalat
- ADP → 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)
- ATP → 2 percig mérünk változást (a reakció lassul)
- FDP → 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul, amíg el nem fogy a NADH)
Az alanin és FDP szabályozó hatása
- az összeállítás ugyanaz, mint az előbb
- ADP → 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)
- alanin → 3 perc inkubálás
- alanin ismét → 2 percig mérünk, a reakció le is állhat
- FDP → aktiválja az enzimet, a reakció újra indul
- A fentieket megismételjük az M-izoformára is.
- A reakcióelegy térfogatának, az extinkcióváltozásnak és az extinkciós koefficiensnek az ismeretében meghatározhatjuk a reakciósebességet.