• 2012. október 2.
• Előadó: Csala Miklós

Acetil-KoA oxidációja a citrátkörben: ciklikus reakció – vannak bizonyos sajátosságok, nincs kezdő lépés, hagyományosan: acetil-KoA belépésétől számítjuk

• Acetil-KoA: acetilcsoport + szállítómolekula: oxálacetáttal reagál, nukleofil addícióval keletkezik egy intermedier [citril-KoA], enzim aktív centrumában marad, majd hidrolízissel KoA leszakad – enzimből citrát és KoA szabadon lép ki

Energetikailag lehetővé teszi az amúgy kedvezőtlen nukleofil addíciót a makroerg tioészter kötés (nem tud stabilizálódni delokalizációval) hidrolízise, nagy szabadenergia-változással, IRREVERZIBILIS lépés enzime: citrát-szintáz

• Citrát izocitráttá alakítása: OH csoport áthelyezése: dehidrálás (vízmolkeula elvonása), majd hidrálás – REVERZIBILIS lépés, egyensúlyra vezető reakciópár, enzim véletlenszerűen helyezi vissza a vízmolekulát a [cisz-akonitátra] – keletkezik citrát és izocitrát is, az akonitát ritkán lép ki az enzim aktív centrumából (enzim sztereo-szelektivitását ezen az enzimen fedezték fel – PROKIRÁLIS MOLEKULÁBÓL nem racém, hanem egyféle királis vegyület keletkezik) enzime: akonitáz

• Izocitrát dehidrogenálása: izocitrát-dehidrogenázzal, dehidrogenálással [oxaloszukcinát] keletkezik, H NAD⁺-ra kerül, majd acetilből származó szén oxidálása, CO₂ és – oxidatív dekarboxilációval – alfa-ketoglutarát keletkezik

IRREVERZIBILIS lépés (oxidatív dekarboxiláció esetén erősen negatív szabadenergia-változás)

• Alfa-ketoglutarát-dehidrogenázzal dehidrogenálás (piruvát dehidrogenálással analóg!), enzim is komplex, három egység, E1 (alfa-ketoglutarát-dehidrogenáz, reakcióra specifikus, de analóg), E2 (dihidrolipoil-transzszukciniláz, reakcióra specifikus, de analóg), E3 (dihidrolipoil-dehidrogenáz/redkutáz ugyanaz az enzim, mint a piruvát -dehidrogenáz komplexben, ugyanaz a gén kódolja!) - NADH és CO₂ keletkezik, szukcinil-KoA termék, IRREVERZIBILIS lépés, oxidációból fedezi a nagyenergiájú tioészter-kötés kialakítását (de nem visszacsinálhatatlan – ciklikus folyamat!), oxidatív dekarboxilálás – kilépett két teljesen oxidált szénatom két lépésben (nem az eredeti acetilcsoportból!)

• Szukcinil – KoA szintetáz: makroerg tioészter kötés hasítása elég energiát biztosít GDP – GTP átalakuláshoz (GTP átadja a P_i-csoportot ADP-nek, így ez egyenértékű ATP keletkezésével), szubsztrát szintű foszforiláció történik, reverzibilis lépés

• Szukcinát-dehidrogenáz: membránhoz kötött flavoprotein, hidrofil szubsztrátokkal rendelkezik – szukcinát – fumarát átalakulás (sztereospecifikus!) során FAD – FADH₂ átalakulás is történik, de a FAD csak prosztetikus csoport, nem lép ki az enzim aktív centrumából – FADH₂ elektronokat ubikinon elektronszállítónak ad át, ez a mitokondrium belső membránjába ágyazott lipofil anyag, szubsztrátja az enzimnek, mert az elektronok rá kerülnek. Része a szukcinát-CoQ reduktáz komplexnek. Reverzibilis lépés

• Fumaráz: fumarát (transz állapot) – malát átalakulás víz kettős kötésbe való beépítésével, nem redoxreakció, sztereospecifikus hidratálás: mindig L-malát keletkezik reverzibilis lépés

• Malát-dehidrogenáz: malátról elektron-hidrogén transzfer NAD⁺-ra, oxálacetát keletkezik, ez a záró lépés. reverzibilis lépés

Energetikai szempontok: három irreverzibilis lépés, a többi reverzibilis, de egy irreverzibilis lépés is kijelöli a ciklus irányát – de két irreverzibilis lépés között beáll az egyensúly. Ennek a lépésnek a szabadenergia-változása pozitív, 29,7 kJ/mol! A koncentráció-viszonyok tolják az átalakulás felé: igen alacsony oxálacetát koncentráció, magas malát-koncentráció, de szükséges még hozzá a [NADH]:[NAD⁺] arány megfelelő értéke – igen alacsony arány szükséges hozzá, oxidatív foszforiláció, azaz a légzés oxidálja a NADH-t, légzés hiányában szabályozás nélkül is leáll a folyamat!

Nettó: 3 NADH, 1 KoQH₂, 1 GTP

CH₃CO-S-KoA + 3 NAD⁺ + KoQ + GDP + Pi + 2H₂O – 2 CO₂ + HS-KoA + 3NADH + KoQH₂ + GTP

Reakciót az egész citromsavciklus (enzimekkel és intermedierekkel) katalizálja, egy enzimként működik – minden intermedierből pontosan ugyanannyi lesz, mint volt, mint katalizátor, változás nélkül nyerhető vissza a reakció után – ha nem fejeződik be a citromsavciklus, sem változik meg az intermedierek össz-mennyisége (egymásba alakulnak) – intermedierek egyenértékűek egymással, egyik intermedier pótolható a másikkal, mert a ciklussal létrehozható

Egyszerűbb, mint a glikolízis szabályozása (az egész szervezetre vonatkozó, magasabb szintű) – citromsavciklus szabályozása csak az energetikai viszonyok figyelembe vételével történik.

Központi szabályozó:

• NADH-NAD⁺ arány, befolyásolja a malát-oxálacetát átalakulást energetikai okokból, gátolja allosztérikusan a három irreverzibilis lépést – ha sok a NADH, nem kell plusz energia-termelés
• ATP és ADP: sok ATP – gátolja az izocitrát-dehidrogenázt, ADP magas szintje aktivál (két molekula egymás koncentrációját meghatározza)

Citrát kivonható a ciklusból: ha a citoplazmában kell acetilcsoport, akkor citrát formájában viszi ki a mitokondriumból, és a plazmában alakul acetilcsoporttá (zsírsavak, koleszterin szintézise) – ezért nem a citrát keletkezését szabályozza az ATP/ADP arány! Magas ATP – citrát kikerül, alacsony ATP – citrát továbbalakul izocitráttá

• Ca²⁺: magas ionkoncentráció: izocitrát-dehidrogenáz, alfa-ketoglutarát aktiválása (Ca²⁺ jel izomösszehúzódást, ingerlést jelent - energia-mozgósítás)
• Alacsony szukcinil-KoA/KoA arány is aktivál kis mértékben

A citrát-ciklus amfibolikus szerepe: katabolizmusban és anabolizmusban is fontos szerepet játszik – katabolikus: lebontás a term. oxi felé

Anabolikus: intermedierek szintetikus alapanyagok, pl. oxálacetát és malát (egyenértékűek az egyensúly miatt) glukóz szintézisben használódnak fel, citrát citoplazmába kerülve zsírsav, koleszterol keletkezésében szerepel, szukcinil-KoA segítségével porfirinek (citkróm, hem)

Szintézishez való intermedier-kivonással elfogyhatnak a katalitikus intermedierek, acetil-KoA-ból nem lesz citrát, csak érintőlegesen vesz részt a ciklusban. Intermedier kivonással párhuzamosan pótolni kell az egyensúlyt valamelyik intermedierrel (nem ugyanazzal – át tudnak alakulni egymásba, egyenértékűek!)

Anaklerózis: visszafizetés, a kivont intermedierek helyett vissza kell juttatni valamilyen intermediert – ciklus anaklerózisa, feltöltése: pl. - aminosavakból, - piruvát-karboxilát segítségével: piruvát ATP befektetésével oxálacetáttá alakul (glukoneogenezis: citrátkör intermedierjéből indul ki, de piruváttal fizeti vissza a szerevezet, piruváton keresztül, de piruvát kihagyásával is történhet a glukóz szintézise! például: aminosavakból) – páratlan szénatomszámú zsírsavak (de humán szervezetben nincsen, táplálékban szintén elenyésző, jelentősége nincs)

Anyagcsere, intermedierek csoportjai: glukoplasztikus és ketoplasztikus – éhezés során energiát, vércukorszintet kell biztosítani – energia megoldható zsírból (nagy mennyiség) Glukoplasztikus: glukóz szintetizálható, ketoplasztikus: ketontestek szintetizálhatók

• 2012. október 3.
• Előadó: Csala Miklós

Eddig történt: elektronok gyűjtése glikolízis, piruvát dekarboxileződése, citromsavciklus során NAD⁺-ra – sok NADH keletkezett

Külső membránon nagy pórusok, kis molkeulák számára átjárható, intermembrán tér összetétele hasonló a sejtplazma összetételéhez, mátrix erősen eltér.

Mátrixból NADH a belső membránra – NADH-KoQ-reduktáz (I. komplex, igazából dehidrogenáz) enzimkomplex (FMN + Fe-S segítségével) KoQ-ra, ubikinonra helyezi az elektronokat, KoQ-citokróm-c-reduktáz (III. komplex, tartalmaz vas-kén fehérjéket, citokrómokat) helyezi át az elektronokat citokróm c-re – intermembrán térben szabadon mozog, nem lép ki – ha mégis, elkezdődik az apoptózis!

Elektronok a citokróm-c-n, elektronszállító – átadja az elektronokat a molekuláris oxigénnek a IV-es komplex segítségével (citokróm-c-oxidáz)

Szukcinát-KoQ reduktáz (II. komplex, FAD és Fe-S tartalmú): szukcinátról levett két elektron az ubikinonra kerül (- protonpumpa nincs!) Zsírsav béta oxidációjának kezdő lépése: acil-KoA dehidrogenáz (FAD, vas-kén fehérjék segítségével): redukálja az ubikinont Glicerol-3-foszfát dehidrogenáz: külső oldalról glicerin-3-foszfátról két elektront a KoQ-ra helyez át, citoplazmatikus intermedier, intermembrán tér enzimje

• különböző forrásokból minden elektron az ubikinonra kerül, innen folyik tovább az elektromos áram (elektron-áram)
• váltakozóan két illetve egy elektron megkötésére képes elektronszállítók (FAD 2, Fe-S 1, ubikinon 1, végül oxigénre 4 kerül)

Oxigén redukciója a negyedik komplexben: egyesével érkeznek az elektronok, az oxigénre mindenképpen 4 elektront kell helyezni (ha a folyamat félresiklik: szuperoxid anion, hidroxilgyök, hidrogén-peroxid keletkezhet!) Fe³⁺ és Cu²⁺ ionok egymás mellett a komplexben → kupri ion kupro ionná redukálódik, ferri ion ferro ionná alakul, érkezik az oxigén, datív kötéseket alkot a két fémionnal, keletkező gyökök állandóan kovalensen kötött állapotban, végső lépésben két hidroxilcsoport – „óvatosság” ellenére is történnek biokémiai balesetek, keletkezik ROS

Elektronszállítók egyre nagyobb redoxpotenciálú vegyületekre kerülnek, minden komplex után némi szabadenergia-csökkenés → 3 komplexben hasznosul a felszabaduló energia I, III, IV. komplex aktív transzporter is az enzimfunkció (elektronáthelyezés) mellett – pumpák, amelyek a redoxreakcióból felszabaduló energiát (negatív szabadenergia-változás) használják fel 4, 4, és 2 proton átpumpálására az intermembrán térbe (kapcsolás), membránközi térben nagyobb lesz a H⁺ koncentráció, elektrokémiai gradiens (koncentráció nagyobb, töltéskülönbség is kialakul) Elektrokémiai gradiens hasznosítható: pl. fehérjetranszport, ATP szintézise

F₁ faktor – ATP aktivitás helye, F_o – oligomicin-szenzitív faktor (tehát nem F null, hanem F O-faktor!), transzmembrán-proton karrier → F_oF₁ ATP-áz. Protonok áthaladva az F_o-n, megforgatják a fehérjét, egy tengely forog az F₁ faktor belsejében, konformáció változások hajtják az ATP szintézist

F_oF₁ prototípusos proton-pumpa: működési mechanizmus szerint (alapműködés) ATP hidrolízise megforgatja a tengelyt, megforgatja F_o-t, ez protont pumpál át – mechanizmus megfordulásának az oka: egy másik, nagyobb kapacitású pumparendszer a membránban – légzési lánc, általa kialakított gradiens ellen az F_oF₁ pumpa nem tud dolgozni, Le-Chatelier elv értelmében visszafordul a folyamat, proton áramlás vált ki ATP szintézist (aktív transzporterekkel lehet ATP-t szintetizálni, ha működésének megfelelő, nagy gradienst hozunk létre!)

Biokémiai kapcsolás – légzési láncban elektronszállítás spontán, H⁺ kiáramlás az intermembrán térbe nem spontán, H⁺ visszaáramlás spontán, ATP termelődés nem spontán: ATP termelődik a membránban

Oxidatív foszforiláció energiamérlege: Pi^2-, ADP^3-, OH^-, ATP^4- a mátrixban – belső membránban ADP/ATP antiporter – kicserélődés kapcsolt folyamatban, Pi-transzporter: kapcsoltan Pi beáramlás, OH-kiáramlás. Két transzporter működése együtt: ATP/ADP antiporter elektrogén, Pi transzporter nem tekinthető annak (kb. Pi^2-/Pi^1,5-), kilépő OH^- reagál egy H⁺-nal – az intermembrán-térből csak HÁROM H⁺ lép be!

Hány ATP keletkezik egy oxigén-atom (O) redukciója során (azaz két elektron megy végig a légzési láncon) – 2,5 ATP keletkezik, mert 10 H⁺ kerül át az intermembrán-térbe, és 4 H⁺ kell egy ATP-hez ha nem NADH hozza az elektronokat (pl. szukcinátról, acil-Koa, glicerin-3-P), kimarad az I. komplex: 6 proton jut át, P/O=1,5 valóságban „kevert” érték – folyamatok egyidejűleg zajlanak le a sejtben

Nincs allosztérikus és kovalens módosítás – energetikai szabályozás: sejt igényel ATP-t? ha igen, folyik a légzési lánc, foszforiláció, ha nincs, a folyamat lelassul.

ATP-szintézis szabályozódik, de a légzés a protongradiensen át hozzá van kapcsolva.

alacsony ADP – magas ATP koncentrációt jelent, sejt energiát nem igényel, F_oF₁ ATP-áz lassul, protongradiens lassabban csökken, emelkedik – H⁺ pumpáláshoz szükséges szabadenergia nő, közelíti a szabadenergia-változás értékét a légzési lánc komplexeinek folyamataiban – kevésbé spontán reakciók, lassuló légzés

magas ADP – alacsony ATP koncentráció, F_oF₁ aktiválódik, intenzív protonátengedés, csökkenő protongradiens, komplexek aktívabban működnek, nagyon negatív szabadenergia-változás, gyorsuló oxigén fogyasztás – AKCEPTOR-KONTROLL (ADP szint szabályoz, a szabadenergia és a foszfát akceptora)

Oxidatív foszforiláció szétkapcsolása: Légzési lánc és ATP szintézis közötti kapcsolat: protongradiens, ha megszűnik, különállóvá válnak a folyamatok. Membránt átjárhatóvá tesszük a protonok számára – áramkör rövidre zárva, nem keletkezik ATP – sőt, eredeti működése szerint protonokat kezd kipumpálni az F_oF₁ ATP-áz, ATP hidrolízis mellett, légzés, mint spontán folyamat felgyorsul, nincs leküzdendő akadály a protongradiens megszűnése miatt, oxigénellátás a limitáló tényező – ÉGÉS történik (NADH, glukóz égése), szabadenergia hővé alakul, mitokondrium hőt termel és a sejtet melegíti

Szétkapcsoló-szer mérgezés: hipoxia, hipertermia, ATP fogyása miatt izomgyengeség, szívleállás, eszméletvesztés, kóma. Például: dinitrofenol (mérgező), termogenin – barna zsírszövetben található, benne sok mitokondrium, a termogenin szétkapcsolja a légzési láncot és a szintézist, hőt termel. (egyes állatokban – téli álom, csecsemőkben előfordul)

Oxidatív foszforiláció gátlószerei (táblázat az előadásból)