Szérum koleszterin- es trigliceridszintek meghatározása. Klinikai vonatkozások
Elméleti háttér
- A lipidek a plazmában oldhatatlanok, ezért azok lipoproteinekben szállítódnak. A lipoproteinek keletkezése, felhasználása során fellépő zavarok különféle hipo- illetve hiperlipoproteinaemiát okozhatnak.
- Ha lipidek plazma koncentrációja meghaladja a metabolizmushoz szükséges mennyiséget, az erekben atherosclerosisos plakk formájában rakódnak le.
- Az összkoleszterin 75%-a LDL („rossz”), 25%-a HDL („jó”).
Gyakorlat
Mintavétel
- Normál és beteg szérum összkoleszterin, HDL- és triglicerid tartalmát határozzuk meg.
- Polianionok és kétértékű kationok jelenlétében a VLDL és LDL frakciók csapadékot képeznek, a felülúszóban centrifugálás után maradó HDL-frakció meghatározható.
- MgCl2-oldat, kicsapó reagens és vizsgálandó plazma.
- Keverés, majd centrifugálás.
- Felülúszóból mikropipettával mintavétel.
Összkoleszterin meghatározás
- Koleszterin-észterázzal hidrolizáljuk a koleszterin-észtereket. [ koleszterin-észter → koleszterin + ZSS ]
- Bakteriális koleszterin oxidáz mellett ekvimoláris H2O2 keletkezik. [ koleszterin → koleszt-4-en-3-on + H2O2 ]
- A H2O2 peroxidáz hatására fenollal és amino-4-antipirinnel vörös komplexet képez, ami 500 nm-en fotometrálható. [ H2O2 + fenol + amino-4-antipirin → kinonimin + 2 H2O ]
| reagensek | 1 | 2 | 3 | 4 |
| koleszterin reagens | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| H2O | 20 μl | |||
| koleszterin standard | 20 μl | |||
| szérum 1 | 20 μl | |||
| szérum 2 | 20 μl |
- Készítünk vak oldatot(1), standard mintát(2), és két mintát a vizsgálandó szérummal (3, 4). A minták az előző táblázat szerint tartalmazzák a reagenseket.
- 5 percig inkubáljuk a mintákat 37 oC-on.
- 500 nm-en fotometráljuk a mintákat → n = 5,17, ha mmol/l
HDL-koleszterin meghatározás
- Polianionok és kétértékű kationok jelenlétében a VLDL és LDL frakciók csapadékot képeznek, a felülúszóban centrifugálás után maradó HDL-frakció meghatározható.
- MgCl2-oldat, kicsapó reagens és vizsgálandó plazma.
- Keverés, majd centrifugálás.
- Felülúszóból mikropipettával mintavétel.
| reagensek | 1 | 2 | 3 | 4 |
| koleszterin reagens | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| H2O | 20 μl | |||
| HDL standard | 20 μl | |||
| szérum 1 | 20 μl | |||
| szérum 2 | 20 μl |
- Ugyanúgy készítünk mintákat, csak plazma helyett kicsapott felülúszót, illetve koleszterin standard helyett HDL-standardot adunk.
- Eljárás ugyanaz(inkubálás, fotometrálás), a számított értéket 1,1-gyel szorozzuk a kicsapó reagens hígító hatása miatt.
Szérum trigliceridszint meghatározása
- A TG-ből a lipáz hatására glicerin és zsírsavak lesznek.
- A glicerin+ATP (Mg2+ és glicerin-kináz jelenlétében) glicerin-3-P + ADP lesz.
- Glicerin-3-P + O2 (glicerin-3-P-oxidáz) → H2O2 + dihidroxi-aceton-P
- H2O2 → színessé tehető, fotometrálható. [ H2O2 + 4-amino-antipirin + ESPAS → vörös kinon-származék + 4 H2O ]
- ESPAS: N-etil-N-szulfopropil-m-anizidin
| reagensek | 1 | 2 | 3 | 4 |
| triglicerid reagens | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| H2O | 20 μl | |||
| triglicerid standard | 20 μl | |||
| szérum 1 | 20 μl | |||
| szérum 2 | 20 μl |
- Készítünk vakot, standard mintát, normál mintát, beteg mintát (a kapott szérumok). A minták a reagenseket az előbbi táblázat szerint tartalmazzák. A minta szérum.
- Eljárás az előbbiek szerint: 5 perc 37 oC-on.
- Számítás az előzőek szerint, megadott n értékekkel.
LDL-koleszterin meghatározása
Az előző adatok felhasználásával:
