====== Szérum koleszterin- es trigliceridszintek meghatározása. Klinikai vonatkozások ======

<WRAP center round download 25%>
{{:aok:biokemia:masodik_felev:koleszterin.pdf|Gyakorlati jegyzet (pdf) letöltése}}
</WRAP>


===== Elméleti háttér =====

  * A lipidek a plazmában oldhatatlanok, ezért azok lipoproteinekben szállítódnak. A lipoproteinek keletkezése, felhasználása során fellépő zavarok különféle hipo- illetve hiperlipoproteinaemiát okozhatnak.
  * Ha lipidek plazma koncentrációja meghaladja a metabolizmushoz szükséges mennyiséget, az erekben atherosclerosisos plakk formájában rakódnak le.
  * Az összkoleszterin **75%-a LDL** ("rossz"), **25%-a HDL** ("jó").

===== Gyakorlat =====

==== Mintavétel ====

  * Normál és beteg szérum összkoleszterin, HDL- és triglicerid tartalmát határozzuk meg.
  * Polianionok és kétértékű kationok jelenlétében a VLDL és LDL frakciók csapadékot képeznek, a felülúszóban centrifugálás után maradó HDL-frakció meghatározható.

  - MgCl<sub>2</sub>-oldat, kicsapó reagens és vizsgálandó plazma.
  - Keverés, majd centrifugálás.
  - Felülúszóból mikropipettával mintavétel.


==== Összkoleszterin meghatározás ====

  * //Koleszterin-észteráz//zal hidrolizáljuk a koleszterin-észtereket.  [ koleszterin-észter -> koleszterin + ZSS ]
  * //Bakteriális koleszterin oxidáz// mellett ekvimoláris H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> keletkezik. [ koleszterin -> koleszt-4-en-3-on + H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> ]
  * A H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> //peroxidáz// hatására fenollal és amino-4-antipirinnel vörös komplexet képez, ami 500 nm-en fotometrálható. [ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> + fenol + amino-4-antipirin -> <wrap em>kinonimin</wrap> + 2 H<sub>2</sub>O ]

| reagensek | 1 | 2 | 3 | 4 |
| koleszterin reagens | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| H<sub>2</sub>O | 20 μl |  |  |  |
| koleszterin standard |  | 20 μl |  |  |
| szérum 1 |  |  | 20 μl |  |
| szérum 2 |  |  |  | 20 μl |

  - Készítünk vak oldatot(1), standard mintát(2), és két mintát a vizsgálandó szérummal (3, 4). A minták az előző táblázat szerint tartalmazzák a reagenseket.
  - 5 percig inkubáljuk a mintákat 37 <sup>o</sup>C-on.
  - 500 nm-en fotometráljuk a mintákat -> n = 5,17, ha mmol/l

{{ :aok:targyak:biokemia_molekularis_es_sejtbiologia:tetel:szerumlipid1.png |}}

==== HDL-koleszterin meghatározás ====

  * Polianionok és kétértékű kationok jelenlétében a VLDL és LDL frakciók csapadékot képeznek, a felülúszóban centrifugálás után maradó HDL-frakció meghatározható.

  - MgCl<sub>2</sub>-oldat, kicsapó reagens és vizsgálandó plazma.
  - Keverés, majd centrifugálás.
  - Felülúszóból mikropipettával mintavétel.

| reagensek | 1 | 2 | 3 | 4 |
| koleszterin reagens | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| H<sub>2</sub>O | 20 μl |  |  |  |
| HDL standard |  | 20 μl |  |  |
| szérum 1 |  |  | 20 μl |  |
| szérum 2 |  |  |  | 20 μl |

  - Ugyanúgy készítünk mintákat, csak plazma helyett kicsapott felülúszót, illetve koleszterin standard helyett **HDL-standard**ot adunk.
  - Eljárás ugyanaz(inkubálás, fotometrálás), a számított értéket 1,1-gyel szorozzuk a kicsapó reagens hígító hatása miatt.

==== Szérum trigliceridszint meghatározása ====

  * A TG-ből a lipáz hatására glicerin és zsírsavak lesznek.
  * A glicerin+ATP (Mg<sup>2+</sup> és glicerin-kináz jelenlétében) glicerin-3-P + ADP lesz.
  * Glicerin-3-P + O<sub>2</sub> (glicerin-3-P-oxidáz) -> H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> + dihidroxi-aceton-P
  * H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> -> színessé tehető, fotometrálható.  [ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>  +  4-amino-antipirin  +  ESPAS ->    <wrap em>vörös kinon-származék</wrap>  + 4 H<sub>2</sub>O ]
    * ESPAS: N-etil-N-szulfopropil-m-anizidin 


| reagensek | 1 | 2 | 3 | 4 |
| triglicerid reagens | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| H<sub>2</sub>O | 20 μl |  |  |  |
| triglicerid standard |  | 20 μl |  |  |
| szérum 1 |  |  | 20 μl |  |
| szérum 2 |  |  |  | 20 μl |

  - Készítünk vakot, standard mintát, normál mintát, beteg mintát (a kapott szérumok). A minták a reagenseket az előbbi táblázat szerint tartalmazzák. A minta szérum.
  - Eljárás az előbbiek szerint: 5 perc 37 <sup>o</sup>C-on.
  - Számítás az előzőek szerint, megadott n értékekkel.

==== LDL-koleszterin meghatározása ====

Az előző adatok felhasználásával:

{{ :aok:targyak:biokemia_molekularis_es_sejtbiologia:tetel:szerumlipid2.png |}}

~~NOTOC~~