====== ADP, ATP, fruktóz-1,6-biszfoszfát és alanin hatása L és M típusú piruvát-kináz izoenzimekre. A mérés módszere. ======
{{:aok:biokemia:masodik_felev:pirkin.pdf|gyakorlati jegyzet}}
===== Piruvát-kináz =====
* A glikolízis és a glukoneogenezis reakciói között a részfolyamatok többsége reverzibilis, irányuk és sebességük a mindenkori szubsztrátok és termékek koncentrációjától függ.
* A glikolízisben és a glukoneogenezisben három olyan irreverzibilis reakció van, ami meghatározza az átalakulás irányát, s ezen reakciók enzimei különböznek a glikolízis és glukoneogenezis között.
* Az egyik ilyen irreverzibilis reakció a glikolízisben a PEP -> piruvát átalakulás, ami egyben szubsztrátszintű foszforiláció is, ADP foszforilálódik ATP-vé. Ezt a reakciót a piruvát-kináz katalizálja.
* A reakcióhoz Mg2+ szükséges:
**PEP + Mg2+ + ADP -> piruvát + Mg2+ + ATP**
* A piruvát-kináz L, M és R típusú izoenzimeit ismerjük. Az L- a májban, az M- az izomban, az R-izoforma pedig a vörösvértestben található meg.
* A piruvát-kináz működése allosztérikus szabályozás alatt áll:
* az ATP, az L-alanin gátolja
* a fruktóz-1,6-biszfoszfát pedig serkenti. (feed forward)
* kovalens szabályozás:
* glukagon -> foszforilál (aktiválja a cAMP függő protein-kinázt) -> gátol
* inzulin -> foszfoprotein-foszfatázt aktivál = defoszforilál -> aktivál
===== Mérés =====
* Az enzim által katalizált reakcióban keletkezett piruvát a LDH által tovább alakítható laktáttá. Eközben NADH oxidálódik NAD-dá.
* A NADH 340 nm-en abszorpciós maximumot ad, így ezen a hullámhosszon fotometrálva az extinkció csökkenése a NADH csökkenését mutatja, ami közvetett módon a piruvát keletkezését jelzi.
* A megfelelő módon csatlakoztatott rekorder az extinkció változását grafikusan megjeleníti.
===== Kivitelezés =====
==== Az ATP és a FDP szabályozó hatásának vizsgálata ====
* vakminta: médium + PEP + NADH
* behelyezzük a fotométerbe, és beindítjuk a rekordert
* LDH
* PK-L
* 2 perc felvétellel felvesszük az alapvonalat
* ADP -> 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)
* ATP -> 2 percig mérünk változást (a reakció lassul)
* FDP -> 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul, amíg el nem fogy a NADH)
==== Az alanin és FDP szabályozó hatása ====
* az összeállítás ugyanaz, mint az előbb
* ADP -> 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)
* alanin -> 3 perc inkubálás
* alanin ismét -> 2 percig mérünk, a reakció le is állhat
* FDP -> aktiválja az enzimet, a reakció újra indul
----
* A fentieket megismételjük az M-izoformára is.
* A reakcióelegy térfogatának, az extinkcióváltozásnak és az extinkciós koefficiensnek az ismeretében meghatározhatjuk a reakciósebességet.