====== Szérum koleszterin- es trigliceridszintek meghatározása. Klinikai vonatkozások ======
{{:aok:biokemia:masodik_felev:koleszterin.pdf|Gyakorlati jegyzet (pdf) letöltése}}
===== Elméleti háttér =====
* A lipidek a plazmában oldhatatlanok, ezért azok lipoproteinekben szállítódnak. A lipoproteinek keletkezése, felhasználása során fellépő zavarok különféle hipo- illetve hiperlipoproteinaemiát okozhatnak.
* Ha lipidek plazma koncentrációja meghaladja a metabolizmushoz szükséges mennyiséget, az erekben atherosclerosisos plakk formájában rakódnak le.
* Az összkoleszterin **75%-a LDL** ("rossz"), **25%-a HDL** ("jó").
===== Gyakorlat =====
==== Mintavétel ====
* Normál és beteg szérum összkoleszterin, HDL- és triglicerid tartalmát határozzuk meg.
* Polianionok és kétértékű kationok jelenlétében a VLDL és LDL frakciók csapadékot képeznek, a felülúszóban centrifugálás után maradó HDL-frakció meghatározható.
- MgCl2-oldat, kicsapó reagens és vizsgálandó plazma.
- Keverés, majd centrifugálás.
- Felülúszóból mikropipettával mintavétel.
==== Összkoleszterin meghatározás ====
* //Koleszterin-észteráz//zal hidrolizáljuk a koleszterin-észtereket. [ koleszterin-észter -> koleszterin + ZSS ]
* //Bakteriális koleszterin oxidáz// mellett ekvimoláris H2O2 keletkezik. [ koleszterin -> koleszt-4-en-3-on + H2O2 ]
* A H2O2 //peroxidáz// hatására fenollal és amino-4-antipirinnel vörös komplexet képez, ami 500 nm-en fotometrálható. [ H2O2 + fenol + amino-4-antipirin -> kinonimin + 2 H2O ]
| reagensek | 1 | 2 | 3 | 4 |
| koleszterin reagens | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| H2O | 20 μl | | | |
| koleszterin standard | | 20 μl | | |
| szérum 1 | | | 20 μl | |
| szérum 2 | | | | 20 μl |
- Készítünk vak oldatot(1), standard mintát(2), és két mintát a vizsgálandó szérummal (3, 4). A minták az előző táblázat szerint tartalmazzák a reagenseket.
- 5 percig inkubáljuk a mintákat 37 oC-on.
- 500 nm-en fotometráljuk a mintákat -> n = 5,17, ha mmol/l
{{ :aok:targyak:biokemia_molekularis_es_sejtbiologia:tetel:szerumlipid1.png |}}
==== HDL-koleszterin meghatározás ====
* Polianionok és kétértékű kationok jelenlétében a VLDL és LDL frakciók csapadékot képeznek, a felülúszóban centrifugálás után maradó HDL-frakció meghatározható.
- MgCl2-oldat, kicsapó reagens és vizsgálandó plazma.
- Keverés, majd centrifugálás.
- Felülúszóból mikropipettával mintavétel.
| reagensek | 1 | 2 | 3 | 4 |
| koleszterin reagens | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| H2O | 20 μl | | | |
| HDL standard | | 20 μl | | |
| szérum 1 | | | 20 μl | |
| szérum 2 | | | | 20 μl |
- Ugyanúgy készítünk mintákat, csak plazma helyett kicsapott felülúszót, illetve koleszterin standard helyett **HDL-standard**ot adunk.
- Eljárás ugyanaz(inkubálás, fotometrálás), a számított értéket 1,1-gyel szorozzuk a kicsapó reagens hígító hatása miatt.
==== Szérum trigliceridszint meghatározása ====
* A TG-ből a lipáz hatására glicerin és zsírsavak lesznek.
* A glicerin+ATP (Mg2+ és glicerin-kináz jelenlétében) glicerin-3-P + ADP lesz.
* Glicerin-3-P + O2 (glicerin-3-P-oxidáz) -> H2O2 + dihidroxi-aceton-P
* H2O2 -> színessé tehető, fotometrálható. [ H2O2 + 4-amino-antipirin + ESPAS -> vörös kinon-származék + 4 H2O ]
* ESPAS: N-etil-N-szulfopropil-m-anizidin
| reagensek | 1 | 2 | 3 | 4 |
| triglicerid reagens | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| H2O | 20 μl | | | |
| triglicerid standard | | 20 μl | | |
| szérum 1 | | | 20 μl | |
| szérum 2 | | | | 20 μl |
- Készítünk vakot, standard mintát, normál mintát, beteg mintát (a kapott szérumok). A minták a reagenseket az előbbi táblázat szerint tartalmazzák. A minta szérum.
- Eljárás az előbbiek szerint: 5 perc 37 oC-on.
- Számítás az előzőek szerint, megadott n értékekkel.
==== LDL-koleszterin meghatározása ====
Az előző adatok felhasználásával:
{{ :aok:targyak:biokemia_molekularis_es_sejtbiologia:tetel:szerumlipid2.png |}}
~~NOTOC~~