====== Mitokondriális légzés P/O hányadosának meghatározása ======

<WRAP center round download 20%>
{{:aok:biokemia:masodik_felev:mitox.pdf|gyakorlati jegyzet}}
</WRAP>


===== Respirációs kontroll és P/O hányados =====

  * Ép mitokondrium esetében megfelelő körülmények között a légzési szubsztrátok egyidejű ATP-szintézis mellett oxidálódnak, és az O<sub>2</sub>-fogyasztás oxigráffal mérhető.
  * Az oxidáció sebessége telítési-[S], -[P<sub>i</sub>] és -[O<sub>2</sub>] jelenlétében csak a mitokondrium koncentrációjától és az ADP jelenlététől függ.
  * Az ADP -> ATP átalakulás a [H<sup>+</sup>]-grádiens megszűntetése révén stimulálja az O<sub>2</sub>-fogyasztást. Ezt nevezzük az O<sub>2</sub>-fogyasztás akceptor-kontrolljának.
  * ADP hiányában a légzés lassú (nyugalmi), de ADP hozzáadásakor többszörösére nő (aktív).
  * Az ADP jelenlétében és elfogyása után mért sebességének aránya az oxidaáció és foszforiláció kapcsoltságára jellemző, és respirációs kontroll-hányadosnak nevezzük.
  * ADP-hozzáadás mellett az O<sub>2</sub>-felvétellel sztöchiometrikus arányban képződik ATP; a sztöchiometriai együttható az ún. P/O-hányados. Intakt mitokondriumban értéke attól függ, hogy a légzési láncba az oxidálódó szubsztrát melyik ponton lép be.
  * Szétkapcsoló szerek jelenlétében a P/O-hányados értéke csökken, mivel foszforiláció nem történik, ugyanakkor az O2-fogyasztás (légzés) nem változik, mert a szétkapcsoló szer csökkentve a [H+]-grádienst a légzést stimulálja.
  * Vannak olyan szerek, amelyek az egész mitokondriális légzést gátolják, így az oxidatív foszforilációt is.
  * **Oligomicin:** az ATP-szintézisét gátolja közvetlenül, de mivel a [H+]-grádiens nem használódik fel, a légzés is gátlódik.
  * **Atraktilozid, karboxiatraktilozid:** az F<sub>o</sub>F<sub>1</sub> csatornát gátolja. Mivel a légzési lánc elektrontranszportja érintetlen, a protongrádiens kiépül, csak nem használódik fel, hasonlóan az oligomicin esetéhez. Ilyenkor szétkapcsolószerekkel a lassú légzést meg lehet gyorsítani.
  * **N-, CO:** a citokróm a3-at gátolják, így az utolsó lépés nem valósul meg, a légzés leáll, ATP-szintézis nincsen.
  * **Antimycin-A:** a III-komplexben a cit. b és c1 közötti elektronátmenetet gátolja.
  * **Rotenon:** NADH-dehidrogenázt gátolja, ami az I. komplex.
  * **Malonát:** a szukcinát-dehidrogenázt kompetitív módon gátolja, ami a II. komplex.
  * A protongrádiens terhére nem csak ATP-szintézis, hanem különböző kationok transzportja is megvalósulhat. azokat az anyagokat, amelyek kationokat juttatnak be a mátrixba, **ionoforok**nak nevezzük. Így ha a **2,3-DNP**-lal szétkapcsoltuk a légzést és a foszforilációt, ionoforokkal a légzés stimulálható, mivel a protongrádiens terhére kationtranszport valósul meg.

===== Műszaki háttér =====

  * Az oldott oxigén mennyiségét polarográfiás oxigénelektróddal mérjük. Az elektródra a polarizátor 0.6 V feszültséget ad, ami mellett az oldott O2 elektrolítikusan redukálódik.
  * Ezen a feszültségen az elektródon átfolyó áram erőssége megfelelő, egyenletes keverés mellett, arányos az oldott oxigén pillanatnyi koncentrációjával, mely érték megfelelő átalakító segítségével egy rekorderen megjeleníthető.
  * A fentiek miatt a reakció ideje alatt a mérőedényt el kell zárni a levegőtől, hogy a keveredés közben a légkörből ne tudjon O2 beleelegyedni.
  * Az adott hőmérsékleten mérhető oldott oxigén koncentrációját 100%-ra kalibráljuk a műszeren. 0%-nak a **Na-ditionit** hozzáadása mellett mért értéket kalibráljuk.

===== Kivitelezés =====

==== A műszert az előzőek szerint kalibráljuk: ====

  * inkubáló oldatba helyezzük az elektródot és a rekorderen ekkor megjelenő adatot 100%-nak jelöljük
  * Na-ditionit hozzáadása mellett mért értéket 0%-nak jelöljük

==== P/O-hányadost határozunk meg: ====

  * inkubáló oldat
  * mitokondrium szuszpenzió
  * szubsztrát (pl. glutamát, malát, szukcinát)
  * nyugalmi légzést veszünk fel
  * ADP-hozzáadás (20μl)
  * aktivált légzés felvétele, majd a lecsengés után a nyugalmi
  * a P/O-hányados a hozzáadott ADP mennyiség és az O2-fogyás alapján határozható meg.

==== ADP, oligomicin, 2,3-DNP és KCN hatása az oxigénfogyasztásra ====

  * inkubáló oldat
  * mitokondrium szuszpenzió
  * légzési szubsztrát
  * ADP
  * felvesszük az oxigénfogyást
  * nagyobb adag ADP
  * oligomicin -> csaknem leáll az oxigénfogyasztás (telítődik a protongrádiens)
  * 2,3-DNP-vel újraindítható (szétkapcsol)
  * KCN-nel ismét leáll (citokróm méreg)

==== Szukcinát oxidáció gátlása malonáttal ====

  * minden ugyanaz, mint a fentiekben
  * a légzési szubsztrát szukcinát, ami a II. komplexen lép be (szukcinát-DH)
  * ezt kompetitív módón gátolja a hozzáadott malonát
  * az oxigénfogyasztás csökken, nagyobb adag malonát mellett leáll

==== Karboxiatraktilozid hatása ====

  * légzési szubsztrát a glutamát-malát
  * ADP
  * majd gátlószer (karboxiatrktilozid)
  * szétkapcsolószerrel (2,3-DNP) újraindítható