====== Az NF-κB és a TGFβ jelpályája, növekedési faktorok ====== * 2013. 02. 19. * Előadó: Buday László Az anyag nincs benne a tankönyvben - megtalálod a Patobiokémiában (Mandl)! ===== NF-κB működése ===== **Nukleáris faktor**, mely kötődni képes az immunglobulinok κ könnyű lánc génjének enhanceréhez a B limfocitákban. Általánosan megtalálható a drosophiláktól az emberig, konzervatív faktor. //Citoplazmában// lokalizált, majd //transzlokálódik// a sejtmagba - kb. 200 immunválaszban, proliferációban, gyulladásban szerepet játszó gén transzkripciójának szabályozásában vesz részt. Központi szerepet játszik a szabályozásban: **Aktiválják:** citokinek (pl. TNF-α), növekedési faktorok, bakteriális fertőző termékek, receptor ligandok, vírusok (Epstein-Barr, HIV), oxidatív stressz (pl. ózon) **Target gének:** (közel 200!) gyulladást kialakító termékek génjei (TNF-α), prosztaglandin, NO szintézis génjei (iNOS, COX-2), proliferáció (ciklin-D), anti-apoptotikus gének, immunválasz ==== Orvosi jelentőség ==== Sejtproliferáció, gyulladás mellett: tumorok kifejlődése Gyulladásos folyamat: precancerosus állapot - gyomorfekély hosszú távon gyomorrákot eredményezhet, krónikus bőrsérülések bőrrákot okozhat. Daganatos elfajulásban NF-κB kulcsszereplő - normál sejtekben **inaktív állapotú**! Kivétel: osztódó T és B limfociták, monociták, astrociták. Legtöbb daganatsejtben **állandóan aktív**. (Telomeráz aktivitáshoz hasonló jelenség.) NF-κB gátlása lassítja a sejtosztódást, elősegíti az apoptózist. NF-κB család egyik tagja protoonkogén (fehérjét termel, ha mutálódik, onkogénné válik, daganat kialakulásához vezethet). **c-Rel** fokozott expressziója esetén (mutálódott gén - onkogén) sejtek transzformációját okozza. Hodgkin limfóma, B sejtes limfóma esetén NF-κB amplifikáció figyelhető meg. NF-κB mátrix metalloproteázok működését fokozza - leváló daganatsejtek szövet közti terjedésében a metalloproteáz az extracelluláris kötőszövetes tereket emészti, ezáltal a metasztázisok kialakulását teszi lehetővé. VEGF - vaszkuláris növekedési faktor, új érképződés induktora. NF-κB fokozza a transzkripcióját. Férfiakban nincs új érképződés (sérülés kivételével), nőkben a menstruációs ciklusban a //méhnyálkahártya proliferációja// esetén van. Daganat növekedésekor angiogenezis történik, ami fiziológiásan kevéssé jellemző - VEGF a daganatokra jellemzően mutatkozik meg, gátlásával a daganat oxigénellátást, tápanyagellátást gátolni lehet, növekedése leállítható. NF-κB kóros aktiválódás megmutatkozik: asthma, diabetes mellitus, rheumatoid arthritis, atherosclerosis, SM ==== NF-κB szerkezete ==== Transzkripciós faktor, tehát minimum **dimérként** működhet - két alegység: 50 és 65 kDa, heterodimér szerkezet. p50 - NF-κB1, NF-κB2 izoformák p65 - RelA, RelB, **c-Rel - protoonkogén!** Nyugvó sejtekben a sejt citoplazmájában található, **IκB (inhibitor)** kapcsolódik hozzá, és lokalizálja a citoszolban. Lefedi a nukleáris lokalizációs szignált, így nem kerülhet be a magba a transzkripciós faktort. ==== Jelpálya ==== Szereplői: TNF-α: jelmolekula, tumor nekrózis faktor alfa - citokin, melyet makrofágok, monociták termelnek. Receptora endothelsejteken, apoptózist tud kiváltani. NIK: NF-κB indukáló szerin/threonin kináz IKK: inhibitor κB-kináz komplex, három alegység (szerin/threonin kináz) Ubikvitin: 76 as polipeptid, ubikvitin ligáz helyezi célfehérje lizin oldalláncára kovalensen, proteaszóma komplexben degradálódnak **Jelpálya felépítése:** TNF-α több receptort összecsap, aktiválja a receptorokat, amelyekhez így hozzákapcsolódik a NIK. Foszforilálja az IKK-t, ami így foszforilálni képes az IκB-t. Foszforilációs kaszkád végül az IκB leválását okozza. Növekedési faktorok receptorukon keresztül aktiválják a pkB-t, aminek szubsztrátja az IKK. IκB foszforiláció hatására konformációváltozás - disszociál a komplexről. IκB-P-t felismeri az ubukvitin-ligáz, ubikvitinálja, proteaszómában lebomlik. Nincs inhibitor, ami eltakarja a maglokalizációs szigált az NF-κB-n - ezáltal a transzkripciós faktor a magpórusokon keresztül bejut a magba. ===== TGF-β jelpálya ===== Transzformáló növekedési faktor β - polipeptid, aktív állapotban dimér, diszulfidhidak kötik össze a diméreket. Kb. 40 citokin tartozik ebbe a családba - "A" család BMP (csont morfogenikus fehérjék), "B" család TGFβ-activin fehérjék családja. Hatásai: sejtproliferáció gátlása, immunszupresszió, extracelluláris mátrix szintézisének szabályozása. ==== Receptorok ==== TGFβ receptor I és II, mindkettő 1TM receptor, és szerin/threonin kináz aktivitással rendelkezik (ritka jellegzetesség). Receptor altípusok közötti eltérés: I-esen "GS domén" található, 5 helyen (egymáshoz közel) foszforilálódni képes. Smad fehérjék: három típusra oszthatók. Receptor által szabályozott Smadok: BMP és TGFβ/activin családhoz kötődők elkülöníthetők - Smad 1, 5, 8 illetve 2, 3. MH-1 - mad homológ 1 domén, DNS kötő, MH-2 - Mad homológ 2 domén, receptorral és a közös Smaddal való interakcióárt felelős. Ezek a Smadok foszforilációs hellyel rendelkeznek. Közös Smad: nincs foszforilációs hely Antagonista Smad: 6, 7 - másik Smadhoz kötve a DNS-hez való kötést akadályozza meg. **Jelpálya felépítése:** TGF béta - II. típusú receptorhoz való kötés, I-es típusú receptort vonz a komplexhez. II. típusú foszforilálja ötszörösen az I-es típust. Foszfátokhoz a Smad 2 fehérje kikötődik, amiben a SARA fehérje segédkezik (Smad horgony, az I. receptoron helyezkedik el, segédfehérje). Smad 2-t megfoszforilálja az I. receptor, a Smad disszociál. Foszforilált Smad 2 Smad 4-hez köt, dimér szerkezettel már transzkripciós faktorként működhetnek, nukleáris lokalizációs szingál felszínre kerül. ====== Növekedési faktorok ====== * 2013. 02. 22. * Előadó: Buday László Növekedési faktorok a //sejtek növekedését// vagy //differenciációját// szabályozzák, pl. EGF fibroblaszt osztódást okoz, NGF idegsejt nyúlványainak kinovését eredményezi - **proliferációt** szabályoznak a növekedési faktorok. ===== Növekedési faktorok általános tulajdonságai ===== * **sejtproliferációt** okoznak, * polpeptidek * sejtfelszíni receptorokhoz kapcsolódnak, * protein tirozinkináz aktivitást stimulálnak * végső soron DNS replikációt, génaktiválódást okoznak **Fontosabb faktorok:** * **EGF** (epidermális) - sérülékeny, daganatok keletkezésében központi szerepet játszik!, * NGF (idegi), * PDGF (trombocitából származó), * TGFα és TGFβ (transzformáló), * FGF (fibroblaszt növekedési), * **inzulin** * interleukinok, egyéb citokinek ==== Tirozin kinázok ==== Fehérjék tirozin oldalláncain **-OH csoportot** foszforilálnak ATP γ foszfátjának terhére. * Receptor TK (9 alosztály), pl. EGF receptor * Nem receptor TK, pl. Src === Szerkezetük === EC domén, ligandkötő hellyel - TM domén, egyszer fúrja át a plazmamembránt. IC oldalon tirozinkináz aktivitással, ATP kötő hellyel rendelkező domén. C terminális részen intracelluláris farokrész - mozgékony, flexibilis. === Aktiváció mechanizmusa === Két lépéses folyamat - nyugvó állapotban egyszeres polipeptidként, diffúzan helyezkednek el a sejtmembránban. Növekedési faktor megjelenése határása: EC domén kötés - receptor dimerizáció a membránban. A receptorok a dimerben keresztfoszforilálják egymást: egyik a másik farki részén foszforilál, vice versa - **autofoszforilációs** folyamat === Src tirozinkináz szerkezete === Tyúk-szarkomában felfedezett TK. Egy polipeptidlánc, melyet **lipidhorgony** köt a membrán belső felszínéhez; a lánc viszonylag rögzítetten helyezkedik el a citoplazmában. Kináz doménjén ATP kötő hellyel rendelkezik. A láncban található még SH3 és SH2 domén (Src-homológ domén, itt fedezték fel először, innen a névadás). * **SH2** 100 as hosszúságú, foszfotirozin oldalláncú fehérjékkel interakció. SH2-t tartalmazó fehérjék: - Adapter fehérjék (nincs katalitikus domén), egymással alapállapotban kapcsolódni képtelen polipeptideket kötnek össze. pl. Grb2 (szerkezete: SH3-SH2-SH3 domének) - Enzimek (van katalitikus domén), pl. PL-Cγ, RasGAP, Src TK család, SHP1 foszfatáz * **SH3** 50 as hosszúságú, prolinban gazdag peptidekkel asszociál (sem α helikális, sem β redős, ún. poliprolin szerkezetet hoz létre a sok prolin a fehérjében) === Autofoszforilált receptor működése === Dimerizált, autofoszforilált receptor: 5-6 fő autofoszforilációs helyen kapott foszfátcsoportot, amihez **enzimaktivitású fehérjék** kötnek, pl. PL-Cγ, Cbl. **Adapterfehérjék** kötődése is történhet, pl. Grb2 - MAP/Erk kaszkádot aktivál; Gab1 - PI 3-kináz/PKB aktivációját eredményezi, Shc - MAP/Erk kináz kaszkádot indít el ==== Ras fehérjék ==== Emberi szervezetben: H, K és N Ras fehérje fordul elő. Kis molekulatömegű, monomer GTP kötő fehérjék, GTP kötő tulajdonságuk megegyezik a heterotrimer G fehérjékével - GDP kötése mellett inaktívak, GTP kötésére aktiválódnak. Enzimaktivitással rendelkeznek - **lassú endogén GTP-áz** aktivitás - hatékony hasításhoz segédfehérjére van szüksége. Src kinázhoz hasonlóan membrán targettáló szekvenciával rendelkeznek - ciszteinhez zsírsav kötődik, ami a membránhoz horgonyoz. Membránhoz való kötődés hibája: inaktivitás. EGF receptor mutáció mellett a leggyakoribb kimutatható mutáció a humán daganatokban - pl. pancreas-rák. **Aktiváció szabályozása**: "Kicserélő fehérjék" (GEF), az inaktivizáló GDP GTP-re való kicserélését végzik. Lassú endogén GTP-áz aktivitást fokoz: GAP fehérjék, Rashoz kötődve konformációváltozással megnövelik az enzimaktivitást. **Inaktiváló fehérjék:** * //p120 GAP// - endogén GTP-áz aktivitás három nagyságrenddel való megnövelése, minden sejtben. * //Neurofibromin//: főként glia- és Schwann-sejtekben, szintén enzimaktivitást fokoz. Enzimaktivitás elvesztésekor Von Recklinghausen-féle neurofibromatózis (I. típusú neurofibromatózis). Ras a növekedési szignált a GTP kötés (nincs hidrolízis) miatt fenntartja, jóindulatú gliasejt daganat jön létre a perifériás idegek mentén. **Kicserélő fehérjék:** //Sos// - szerkezete: C terminálison prolinban gazdag régió (SH3 doménnal rendelkező fehérje számára kiváló kötőhely), majd Cdc25 katalitikus domén (Ras-t aktiválja), PH domén (plextrin homológia domén, PI 3-kináz termékeket köt). EGF receptorhoz kötődő Grb2 rögzíti a membrán közelében az Sos-t, ami így a Ras közelébe kerül. A GDP letaszítása után a környezetben lévő guanin nukleotidot nagy affinitással köti a Ras - GTP 10-szeres koncentrációban fordul elő a GDP-hez képest, tízszer akkora eséllyel aktiválódik a fehérje.